[EN] THE INTRODUCTION AND EXPRESSION OF LARGE GENOMIC SEQUENCES IN TRANSGENIC ANIMALS<br/>[FR] INTRODUCTION ET EXPRESSION DE GRANDES SEQUENCES GENOMIQUES CHEZ DES ANIMAUX TRANSGENIQUES
申请人:THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY
公开号:WO1994023049A2
公开(公告)日:1994-10-13
(EN) This invention provides a method for the efficient introduction of cloned, very high molecular weight DNA into the germline of mice, whereby large genes can be expressed appropriately in transgenic mice. The $g(b)-amyloid precursor protein (APP) is known to be a complex gene consisting of 18 exons with total size estimates greater than 170 kb encoding three major RNA splicing forms. According to this invention, a neomycin resistance cassette is introduced into one of the arms of a 650 kb yeast artificial chromosome (YAC) which contains the entire unrearranged APP gene within 400 kb. Following gel purification, the YAC is introduced into embryonic stem (ES) cells by lipid mediated transfection. Neomycin resistant ES lines are isolated with the human APP gene stably integrated in an unrearranged state and expressing properly initiated and spliced full length human APP mRNA and APP human protein. Mouse chimeras generated from these ES lines transmit the YAC to their offspring, generating novel APP YAC transgenic mice. These transgenic mice express human APP gene products at significant levels in brain and peripheral tissues that mirror the expression of endogenous mouse APP gene products. This procedure will have great utility for transgenic studies of gene expression involving large genes and gene complexes.(FR) L'invention concerne un procédé permettant l'introduction efficace d'ADN cloné de très haut poids moléculaire dans la lignée germinale de souris, ce qui permet d'obtenir l'expression, de façon appropriée, de grands gènes chez des souris transgéniques. La protéine précurseur $g(b)-amyloide (APP) est connue comme étant un gène complexe constitué de 18 exons dont la taille totale est estimée à une valeur dépassant 170 kb, codant trois formes d'épissages importantes de l'ARN. Selon l'invention, une cassette présentant une résistance à la néomycine est introduite dans un des bras d'un chromosome artificiel de levure (YAC) de 650 kb qui contient le gène d'APP entier non remanié dans 400 kb. Après une purification sur gel, le YAC est introduit dans des cellules souches embryonnaires (ES) par transfection à médiation lipidique. Les lignées ES résistant à la néomycine sont isolées, le gène d'APP humain étant intégré de façon stable, à l'état non remanié, et expriment une protéine humaine APP et un ARNm d'APP humaine de pleine longueur correctement amorçés et épissés. Des souris chimères générées à partir de ces lignées ES transmettent le YAC à leur progéniture, générant ainsi de nouvelles souris transgéniques APP YAC. Ces souris transgéniques expriment des produits géniques d'APP humaine avec des rendements importants dans le cerveau et les tissus périphériques qui reproduisent l'expression de produits géniques d'APP de la souris endogènes. Ce procédé sera d'une grande utilité dans les études transgéniques de l'expression de gènes concernant de grands gènes et complexes géniques.