Recreating the natural evolutionary trend in key microdomains provides an effective strategy for engineering of a thermomicrobial N-demethylase
作者:Yu Xin、Chen Shen、Mengwei Tang、Zitao Guo、Yi Shi、Zhenghua Gu、Jun Shao、Liang Zhang
DOI:10.1016/j.jbc.2022.101656
日期:2022.3
were recreated by site-directed mutagenesis. The single and double substitution variants catalyzed the N-demethylation of N-methyl-L-amino acids up to 1800- and 6000-fold faster than the wild type, respectively. Additionally, these single substitution variants catalyzed the terminal N-demethylation of non-amino-acid compounds and the oxidation of the main chain -C-N- bond to a -C=N- bond in the nitrogen-containing
据报道, N-去甲基化酶可以去除伯胺或仲胺上的甲基,这可能会进一步影响生物大分子或化合物的性质和功能;然而,尚未系统地研究N-去甲基化酶的底物范围和稳健性。在这里,我们报告了Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶 (TrSOX) 关键微域中自然进化的再现,这是一种N-脱甲基酶具有显着的稳定性(熔化温度超过 100 °C)和对映选择性,可增强底物范围和对 -CN- 键的催化效率。对于初始框架,我们通过结晶和 X 射线衍射 (XRD) 获得了 TrSOX 的结构。然后使用祖先序列重建 (ASR) 识别关键微结构域的非保守残基(包括催化环、辅酶口袋、底物口袋和入口位点)的自然进化,并通过位点重建自然进化过程中产生的替换。定向诱变。单取代和双取代变体催化N的N-去甲基化-甲基-L-氨基酸分别比野生型快 1800 倍和 6000 倍。此外,这些单取代变体催化了非氨基酸化合物的末端N