摘要:
本发明提供了编码人类细胞色素P450 2E1的核酸,其中包括63个核苷酸的5'端缺失,从而在5'端的第一个密码子位置编码甲硫氨酸,第二个密码子位置编码ATG,并在5'区域进行了沉默的腺嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸替换。本发明还提供了编码人类细胞色素P450 2C10的核酸,其中包括核苷酸7到60的5'端缺失,从而在5'端的第一个密码子位置编码甲硫氨酸,第二个位置编码丙氨酸,并在5'区域进行了沉默的腺嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸替换。本发明还提供了从宿主细胞培养物中纯化重组细胞色素P450蛋白的方法,包括以下步骤:a.分离宿主细胞以准备其膜;b.向膜中添加非离子性洗涤剂,浓度为0.8%至2%(w/v),洗涤剂与蛋白的比例为4:1至10:1;c.向膜中添加离子性洗涤剂,浓度为0.4%至0.8%(w/v),洗涤剂与蛋白的比例为2:1至4:1;d.离心膜洗涤剂混合物以去除不溶性物质;e.按以下顺序纯化蛋白质:i)通过二乙基氨基乙基珠柱;ii)通过羧甲基珠柱;和iii)通过羟基磷灰石柱。本发明还提供了纯化的重组人类细胞色素P450 1A1,其保留了其催化活性,如催化7-乙氧基荧光素O-去乙基化和苯并(a)芘3-羟基化。