摘要:
通过质谱(MS)直接检测和定量蛋白质/肽的棕榈酰化是一项具有挑战性的任务,因为在样品制备和串联质谱分析过程中棕榈酰容易丢失。此外,由于棕榈酰化肽与其未修饰的对应物之间的疏水性存在很大差异,因此无法在一次液相色谱-质谱实验中同时对它们进行分析。在此,我们研究了几种模型棕榈酰肽在不同的孵育和破碎条件下棕榈酰化的稳定性。研究发现,在碳酸氢铵缓冲液中使用二硫苏糖醇作为还原剂的常规胰蛋白酶消化方案会导致棕榈酰的大量损失。因此,建议在以三(2-羧乙基)膦为还原剂的中性三缓冲液中进行样品制备,在这种条件下,棕榈酰化基本得以保留。在串联质谱分析中,碰撞诱导解离经常导致棕榈酰损失,而电子捕获解离则经常产生远离骨架裂解位点的次级侧链损失,因此不建议使用它们来准确确定棕榈酰化位点。相反,在电子转移解离过程中,棕榈酰基大部分被保留下来,从而产生广泛的残基间裂解覆盖,使其成为棕榈酰肽分析的理想破碎方法。最后,用全氟烷基标签(N-[(3-perfluorooctyl)propyl] iodoacetamide)对未修饰的肽进行衍生处理,可显著增加其疏水性,使其能够与棕榈酰肽同时进行分析,从而对棕榈酰化进行相对定量。