在组学研究中，当我们获得差异基因或代谢物列表后，如何将这些零散数据转化为具有生物学意义的通路机制？KEGG 数据库的数据分析功能正是连接数据与机制的关键桥梁。相比基础的数据检索，KEGG 的分析工具能实现从基因注释到通路富集、从单一数据到多组学整合的深度分析。
本文将系统介绍 KEGG 数据分析的核心工具、标准化流程及实战技巧，特别纳入 2025 年最新功能更新，助力研究者高效挖掘数据背后的生物学故事。
一、核心分析工具升级亮点
KEGG 持续优化其分析工具矩阵，2025 年重点提升了多组学整合能力和物种覆盖范围。在通路数据库（PATHWAY）中，新增了 hormone signaling 通路（2025 年 1 月上线），完善了内分泌相关研究的分析资源。同时扩展了 17 种细菌和 8 种真核生物的物种特异性通路，包括大西洋鲭鱼（ssco）、十三线地松鼠（iti）等模式生物，使非模式生物研究也能获得精准的通路注释。
KEGG Mapper作为最常用的通路映射工具，新增了 "多物种比较模式"。研究者可同时输入人类（hsa）、小鼠（mmu）的基因列表，在同源通路图上用不同颜色标记跨物种的基因表达变化，直观展示进化保守的调控模块。操作时只需在 "Organism" 参数中输入多个物种代码（如 hsa,mmu），工具会自动匹配 KO 系统的同源基因。
Pathview 包的 2025 版强化了多组学数据整合功能。不仅支持基因与代谢物数据的同图可视化，还能处理多达 6 个样本的比较分析。通过设置multi.state = TRUE参数，可将基因节点和化合物节点分割为多个片段，用热图渐变颜色展示不同样本的表达差异。例如在乳腺癌研究中，可同时展示 3 个肿瘤样本与 3 个正常样本在糖酵解通路上的基因表达和代谢物浓度变化，清晰识别样本分组特异性的通路异常。
BlastKOALA工具优化了宏基因组数据的注释算法，针对肠道菌群等复杂样本，新增了 "功能冗余度计算" 参数，能量化不同菌株在同一通路中的功能补偿效应，这对微生物组研究的通路活性分析尤为重要。
图片来源：Minoru Kanehisa, Yoko Sato, Kanae Morishima, BlastKOALA and GhostKOALA: KEGG Tools for Functional Characterization of Genome and Metagenome Sequences, Journal of Molecular Biology, Volume 428, Issue 4, 2016, Pages 726-731, ISSN 0022-2836, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2015.11.006.
二、标准化分析流程实战
1. 数据预处理：ID 转换的关键技巧
KEGG 分析的准确性始于正确的 ID 格式。2025 年通路注释数据显示，采用官方认可的 ID 类型可使映射率提升至 99.2%。对于 RNA-seq 数据，建议将基因名转换为 Entrez ID 或 UniProt ID：人类基因用hsa:10458格式，小鼠基因用mmu:12345格式。转换工具推荐使用 UniProt 的 ID mapping 功能，设置 "From" 为 Gene name，"To" 为 UniProtKB，"Organism" 限定物种。
代谢组数据需将化合物名称转换为 KEGG C 编号。例如 "乳酸" 对应 C00186，"ATP" 对应 C00002。可通过 KEGG COMPOUND 数据库的批量检索功能，或使用 R 包MetaboAnalystR的convertCompoundID函数实现批量转换。对于非标代谢物，可通过精确分子量在 KEGG COMPOUND 中模糊搜索可能的匹配项。
2. 通路富集分析的核心参数
富集分析本质是通过超几何检验判断目标基因在特定通路中的分布是否具有统计学显著性。使用clusterProfiler包的enrichKEGG函数时，关键参数设置如下：
● organism="hsa"：指定物种，代谢物分析需设为"cpd"
● pvalueCutoff=0.05：原始 p 值阈值
● qvalueCutoff=0.2：多重检验校正后的阈值
2025 年更新的enrichKEGG函数已支持代谢物富集分析，直接输入 C 编号列表即可。例如：
需注意代谢物分析需使用最新版 clusterProfiler（≥4.6.0）。
3. 结果可视化的多层次呈现
显著富集通路的展示需兼顾统计显著性与生物学意义：
● 气泡图：用dotplot()函数绘制，X 轴为基因比率，点大小表示基因数，颜色映射 q 值
● 通路着色图：通过 Pathview 生成，设置gene.data和cpd.data参数实现基因 - 代谢物共展示
● 层级树状图：利用 KEGG BRITE 的分类体系，用treeplot()展示通路间的功能关联
对于多组学数据，推荐使用 Pathview 的 Graphviz 视图（设置kegg.native = FALSE），该模式用椭圆表示化合物节点，矩形表示基因节点，箭头方向清晰展示代谢流方向。
三、深度解读策略与案例分析
1. 关键指标的生物学解读
富集结果中的富集因子（Rich factor） 反映通路被关注基因覆盖的程度，例如富集因子 2.5 表示目标基因集中该通路的基因比例是背景基因的 2.5 倍。q 值需严格控制在 0.05 以下，避免假阳性结果。在肿瘤研究中，若 hsa04110 细胞周期通路 q=0.002 且包含 15 个差异基因，结合临床数据可推测该通路异常可能促进细胞增殖。
需特别注意通路的层级关系：map 开头的全局通路（如 map01230）适合初步筛选，物种特异性通路（如 hsa01230）适合深入分析。2025 年新增的激素信号通路可与经典通路关联分析，例如乳腺癌研究中发现雌激素信号通路（hsa04960）与细胞周期通路存在交叉调控。
2. 多组学整合案例
以肝癌多组学研究为例，完整分析流程包括：
1. 用 BlastKOALA 注释转录组数据，获得差异基因的 KO 编号
2. 通过enrichKEGG发现 hsa00010 糖酵解通路显著富集（q=1.3e-6）
3. 用 Pathview 整合糖酵解通路的基因表达（HK2 上调 2.8 倍）和代谢物数据（乳酸 C00186 升高 1.7 倍）
4. 在通路图中发现 NAD+/NADH 比值异常，结合 LinkDB 关联到 SIRT1 基因的表达变化
该案例通过 KEGG 分析将基因表达异常与代谢表型关联，揭示了 "Warburg 效应" 在肝癌中的分子机制。
四、进阶技巧与常见问题解决
1. 批量分析与自动化工具
对于高通量数据，KEGG REST API 可实现批量处理：
● 获取人类所有通路列表：http://rest.kegg.jp/list/pathway/hsa
● 批量注释基因 KO：http://rest.kegg.jp/link/ko/hsa:10458
● 导出通路图片：http://rest.kegg.jp/get/hsa04110/image
R 语言用户可结合httr包编写循环脚本，实现数百个基因的自动化注释。
2. 常见问题解决方案
映射率低：检查 ID 格式是否包含物种前缀（如 hsa:），尝试转换为不同 ID 类型重试；
无显著通路：适当放宽 p 值阈值至 0.1，或增加样本量；
代谢物注释不全：使用 KEGG COMPOUND 的 "Similar compounds" 功能查找同源物。
KEGG 数据分析功能已从单一通路注释发展为多组学整合平台。掌握这些工具不仅能高效完成常规富集分析，更能深入挖掘基因 - 代谢物 - 通路之间的调控网络。建议定期查看 KEGG 更新日志（https://www.kegg.jp/kegg/docs/updnote.html），及时利用新增的物种数据和分析功能。
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