在生命科学与化学交叉的前沿领域，核酸化学一直占据着举足轻重的地位。核酸作为遗传信息的携带者和生命活动的重要调控者，其结构与功能的研究始终是探索生命奥秘的关键路径。苏糖核酸（Threose Nucleic Acid，TNA）作为一种非天然核酸，凭借其独特的化学结构和潜在的生物学功能，逐渐成为生命起源研究和合成生物学领域的热点。
南京大学于涵洋团队通过Zn²⁺依赖的体外筛选策略，首次获得了具有天然3'-5'RNA连接活性的TNA酶24-1。该酶通过酸-碱催化机制促进3'-OH去质子化，并利用Zn²⁺稳定过渡态，最终实现高选择性的磷酸二酯键形成。研究还验证了其催化产物的功能活性，为TNA在原始催化环境中的角色提供了直接证据，并拓展了其在合成生物学中的应用潜力。
一、研究背景
（一）TNA 的独特性质与潜在地位
苏糖核酸（TNA）是一种合成的遗传聚合物，其糖骨架由苏糖替代了 RNA 中的核糖。TNA具有化学结构简单、碱基配对能力及折叠形成功能三级结构的特点，因此其被推测为早期生命演化中可能的遗传物质前体或RNA的祖先分子。TNA 能够与 RNA 或 DNA 通过碱基互补配对原则形成稳定的杂交双链，展现出与天然核酸相似的遗传信息传递潜力 。TNA 对核酸酶具有高度抗性，在生物体内环境中能够保持结构稳定，这一特性使其在生物医学领域具有潜在的应用价值。
（二）RNA 连接反应的重要性与挑战
RNA 分子中的 3′-5′磷酸二酯键是构成 RNA 链的核心化学键，它将单个核糖核苷酸连接成具有特定序列和功能的 RNA 分子。然而，实现 RNA 的高效、精准连接面临诸多挑战。天然条件下，RNA 连接反应效率较低，且容易产生副反应，尽管已有研究报道了具有RNA内切酶或非天然2'-5'连接活性的TNA酶，但天然3'-5'连接的催化能力仍是未解之谜，这一空白制约了 TNA 在 RNA 合成及生命起源研究中的应用。
二、研究核心成果：TNA 酶的发现与催化机制解析
（一）TNA 酶的筛选与鉴定
于涵洋团队通过精心设计的体外筛选策略，成功从随机 TNA 文库中筛选出具有天然 3′-5′ RNA 连接活性的 TNA 酶 24-1。筛选过程以 Zn²⁺依赖的 RNA 连接反应为基础，利用尿素 - PAGE 凝胶分析对反应产物进行监测，通过与已知具有 RNA 连接活性的 DNA 酶 7DE5 进行对比，验证 TNA 酶的催化活性。经过多轮筛选和优化，最终确定了 TNA 酶 24-1 的核心序列，该序列包含 29 个碱基，能够高效催化两个 RNA 寡核苷酸之间的连接反应。在优化后的反应条件下（pH 7.3、23°C、1 mM ZnCl₂），TNA 酶 24-1 催化的 RNA 连接反应在 12 小时内产率可达 87%，催化速率常数为 0.39 h⁻¹，展现出优异的催化性能，显著优于作为对照的 DNA 酶 7DE5。
图 1. 具有天然 RNA 连接酶活性的 TNA 酶的体外筛选
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
（二）TNA 酶的催化特性与底物特异性
TNA 酶 24-1 的催化活性高度依赖 Zn²⁺离子。研究发现，只有 Zn²⁺能够为 TNA 酶 24-1 提供有效的催化环境，其他二价金属离子，如 Mg²⁺、Ca²⁺、Pb²⁺等，虽然在一定程度上能够支持反应，但催化效率远低于 Zn²⁺。Zn²⁺在催化过程中发挥着关键作用，它能够促进 RNA 底物 3′-OH 的去质子化，使其成为更具亲核性的攻击基团，同时稳定反应过渡态中产生的负电荷，从而加速磷酸二酯键的形成。
图2. TNA 酶的定向进化与突变分析
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
在底物特异性方面，TNA 酶 24-1 对连接位点的碱基具有一定的选择性，尤其偏好底物连接位点处为 D|G（D 代表 A、G 或 U）的组合。对于 RNA 底物的长度，TNA 酶 24-1 能够接纳的最短 RNA 底物分别为 11 nt 和 7 nt，并且在底物序列存在一定变异的情况下，如转位突变，仍能保持一定的催化活性，展现出良好的底物容忍性。这种底物特异性确保了 TNA 酶 24-1 催化连接反应的准确性，同时也为其在不同 RNA 序列连接中的应用提供了可能。
图3. NA 酶 24-1 的生化特性及底物序列要求
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
（三）TNA 酶的催化机制与结构基础
通过对 TNA 酶 24-1 的序列分析和结构预测，团队发现其具有保守的二级结构，包含茎环结构等特征性区域。关键位点的突变实验表明，这些保守结构区域对于 TNA 酶 24-1 的催化活性至关重要。当对这些关键位点进行突变时，TNA 酶 24-1 的催化效率显著降低，甚至完全丧失活性，说明这些结构区域参与了底物识别、结合以及催化反应的关键过程。
图 4. TNA 酶 24-1 催化产生 RNA 连接酶核酶
（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
基于实验结果，团队提出了 TNA 酶 24-1 催化 RNA 3′-5′连接的作用机制。在 Zn²⁺的辅助下，TNA 酶 24-1 通过酸碱催化机制促进反应进行。具体过程为，Zn²⁺与 RNA 底物的 3′-OH 结合，降低 3′-OH 的酸性，使其更容易发生去质子化，形成亲核性更强的 O⁻。O⁻对另一个 RNA 底物的 5′- 三磷酸基团进行亲核攻击，同时 Zn²⁺稳定反应过渡态中产生的负电荷，促进磷酸二酯键的形成，最终实现 RNA 的 3′-5′连接。这一机制的揭示，不仅阐明了 TNA 酶 24-1 的催化本质，也为后续人工核酸酶的设计和优化提供了重要的理论依据。
三、研究意义
本研究成功开发了一种新型苏糖核酸酶（TNA酶），其依赖Zn²⁺催化RNA的天然3'-5'磷酸二酯键连接，能够在pH 7.3和23°C条件下以0.39 h⁻¹的催化速率常数高效催化两个RNA寡核苷酸的3'-OH与5'-三磷酸基团间的连接反应，并在12小时内达到87%的产率。实验进一步证明，该TNA酶可连接RNA片段生成功能性产物（如核酶）。这一发现不仅深化了对生命起源化学机制的理解，还为合成生物学和生物医学领域提供了新型分子工具，展现了TNA从基础研究到实际应用的双重价值。
四、文献信息
文献标题：A Threose Nucleic Acid (TNA) Enzyme Catalyzing Native 3′-5′ Ligation of RNA
作者：Juan Wang, Feng Han, Ye Zou, Mengqi Wang, Yao Wang, Jia-Yu Chen, Hanyang Yu
发表期刊：Journal of the American Chemical Society
DOI：10.1021/jacs.5c07235
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.5c07235
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